YaChudo

Нокаут гена

Переглядів: 0. Оновлено 03.11.2026.

У Вікіпедії є статті про інші значення цього терміна: Нокаут (значення).

Нокаутування генів (англ. Gene knockouts, або «вимкнення генів») — це основний інструмент генетичної інженерії. Він дозволяє вченим цілеспрямовано вимкнути (або видалити) роботу конкретного гена в генетичному коді організму. Це як вирвати сторінку з інструкцією, щоб подивитися, як це вплине на роботу всієї системи.

Для цього використовують високоточні методи, як-от Гомологічна рекомбінація, CRISPR-Cas9 та TALENs.

Навіщо вимикають гени?

Основна мета нокаутування генів — зрозуміти, за що відповідає певний ген. Дослідники порівнюють організм, у якого ген вимкнено (нокаут), з нормальним організмом. Якщо після вимкнення гена виникає зміна (наприклад, тварина стає сліпою або стійкою до хвороби), це означає, що вимкнений ген відповідав за цю функцію.

Нокаути широко застосовуються:

Лабораторна миша, у якої вимкнено ген, що впливає на ріст волосся (ліворуч), поруч зі звичайною лабораторною мишею.

Типи «вимкнення»

  • Повний нокаут: Ген вимкнено назавжди і у всіх клітинах організму.
  • Умовний нокаут: Ген можна «вимкнути» лише у певній тканині (наприклад, лише в клітинах печінки) або у потрібний час (наприклад, лише у дорослому віці). Це важливо, коли повне вимкнення гена призвело б до смерті зародка.

Споріднені терміни

  • Нок-ін генів (Gene knock-in): Протилежний процес. Це заміна одного гена на інший, а не його видалення.
  • Множинні нокаути: Якщо вимкнено два гени — це подвійний нокаут (DKO), три гени — потрійний нокаут (TKO), і так далі.
  • Зиготність: Важливо, чи вимкнена одна копія гена (з двох наявних — гетерозиготний нокаут) чи обидві копії (гомозиготний нокаут).

Методологія

Нокаутування генів виконується на рівні ДНК, тобто вносяться постійні зміни в генетичний код.

1. Мутації, що відбулися природним шляхом

Спочатку ідентифікувалися природні мутації, а потім втрата або інактивація гена підтверджувалася за допомогою секвенування ДНК або інших методів.[1]

Нокаутування генів шляхом мутацій зазвичай проводиться в бактеріях. Ранній приклад використання цієї техніки на Escherichia coli був опублікований у 1989 році.[2]

2. Гасіння генів (Knockdown)

Для досліджень нокауту генів також використовується РНК-інтерференція (РНКі), відома як **гасіння генів**. Це як заглушити голос гена. Замість того, щоб видаляти інструкцію (ДНК), вчені використовують спеціальні РНК-молекули (siRNA або shRNA) для руйнування повідомлення (мРНК), яке ген посилає для виробництва білка. В результаті білка виробляється менше, але ген залишається на місці. Це тимчасовий ефект.[3]

3. Гомологічна рекомбінація

Традиційно нокаутування досягалося за допомогою гомологічної рекомбінації. Це як заміна розділу книги (гену) на новий розділ, який нічого не значить. У такий спосіб були створені сотні мишачих моделей різних людських захворювань.[4]

Це передбачає створення конструкції ДНК, що містить бажану мутацію, часто маркер стійкості до ліків, який замінює ген.[5] Оскільки цей процес є неефективним (лише $10^{-2}$ до $10^{-3}$ інтеграцій ДНК)[5][6], для відбору клітин з нокаутом використовують маркер стійкості до ліків.

4. Сайт-специфічні нуклеази (сучасні методи)

Це найефективніші та найточніші методи, що використовують «молекулярні ножиці» для розрізання ДНК. Ремонт розриву клітинними механізмами часто відбувається з помилками (вставки чи видалення), що викликає мутації зі зсувом рамки зчитування і вимикає ген.[6]

  • Нуклеази з цинковими пальцями (ZFNs): Використовують ДНК-зв'язуючі домени та ендонуклеазу для розрізання ДНК.[7]
  • Нуклеази-ефектори, схожі на активатори транскрипції (TALENs): Містять ДНК-зв'язуючий домен, який розпізнає по одній парі основ, та нуклеазу.[8]
  • CRISPR-Cas9: Найпопулярніший інструмент. Спеціальна РНК наводить фермент Cas9 (ножиці) точно на цільовий ген. Cas9 розрізає ДНК, що призводить до інактивації гена.[7][9]

5. Умовні нокаути (Conditional Knockouts)

Умовний нокаут дозволяє видаляти ген у спосіб, специфічний для певної тканини.[10] Це досягається шляхом введення коротких послідовностей loxP навколо гена, які пізніше розпізнаються ферментом Cre-рекомбіназа.[11]

Використання

Нокаути в першу чергу використовуються для:

  • Розуміння функції специфічного гена або ділянки ДНК шляхом порівняння нокаутованого організму з диким типом.
  • Як інструмент для скринінгу ліків у розробці, наприклад, у Saccharomyces cerevisiae з використанням бібліотек нокаутних організмів.[12]

Див. також

Примітки

  1. ↑ Griffiths AJ, Miller JH, Suzuki DT, Lewontin WC, Gelbart WM (2000). An Introduction to Genetic Analysis (вид. 7th). New York: W. H. Freeman. ISBN 978-0-7167-3771-1.
  2. ↑ Hamilton CM, Aldea M, Washburn BK, Babitzke P, Kushner SR (Вересень 1989). New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171 (9): 4617—4622. doi:10.1128/jb.171.9.4617-4622.1989. PMC 210259. PMID 2548993.
  3. ↑ Caplen, Natasha J (Липень 2003). RNAi as a gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy (англ.). 3 (4): 575—586. doi:10.1517/14712598.3.4.575. ISSN 1471-2598. PMID 12831363.
  4. ↑ The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2007. The Nobel Foundation. Процитовано 15 грудня 2008.
  5. ↑ а б Hall, Bradford; Limaye, Advait; Kulkarni, Ashok B. (1 вересня 2009). Overview: Generation of Gene Knockout Mice. Current Protocols in Cell Biology. Wiley-Blackwell. 44: Unit 19.12 19.12.1–17. doi:10.1002/0471143030.cb1912s44. ISBN 978-0-471-14303-1. PMC 2782548. PMID 19731224.
  6. ↑ а б Santiago, Yolanda; Chan, Edmond; Liu, Pei-Qi; Orlando, Salvatore; Zhang, Lin; Urnov, Fyodor D.; Holmes, Michael C.; Guschin, Dmitry; Waite, Adam (15 квітня 2008). Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (15): 5809—5814. doi:10.1073/pnas.0800940105. ISSN 0027-8424. PMC 2299223. PMID 18359850.
  7. ↑ а б Gaj, Thomas; Gersbach, Charles A.; Barbas, Carlos F. (2013). ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7): 397—405. doi:10.1016/j.tibtech.2013.04.004. PMC 3694601. PMID 23664777.
  8. ↑ Joung, J. Keith; Sander, Jeffry D. (Січень 2013). TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1): 49—55. doi:10.1038/nrm3486. ISSN 1471-0080. PMC 3547402. PMID 23169466.
  9. ↑ Ni, Wei; Qiao, Jun; Hu, Shengwei; Zhao, Xinxia; Regouski, Misha; Yang, Min; Polejaeva, Irina A.; Chen, Chuangfu (4 вересня 2014). Efficient Gene Knockout in Goats Using CRISPR/Cas9 System. PLOS ONE. 9 (9) e106718. Bibcode:2014PLoSO...9j6718N. doi:10.1371/journal.pone.0106718. ISSN 1932-6203. PMC 4154755. PMID 25188313.
  10. ↑ Le, Yunzheng; Sauer, Brian (1 березня 2001). Conditional gene knockout using cre recombinase. Molecular Biotechnology. 17 (3): 269—275. doi:10.1385/MB:17:3:269. ISSN 1073-6085. PMID 11434315. S2CID 41578035.
  11. ↑ Kos, Claudine H. (Червень 2004). Methods in Nutrition Science: Cre/loxP System for Generating Tissue-specific Knockout Mouse Models. Nutrition Reviews (англ.). 62 (6): 243—246. doi:10.1111/j.1753-4887.2004.tb00046.x.
  12. ↑ YeastDeletionWebPages. Архів оригіналу за 29 вересня 2012. Процитовано 21 лютого 2017.

Посилання

Джерело: стаття у Вікіпедії та історія редагувань (автори).